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多肽修饰
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PNA合成

PNA(Peptide nucleic acid,肽核酸)是一种人工合成的类似于DNA,RNA的化学物质。PNA的骨架是由重复的N-2-(氨乙基)-甘氨酸为单位,经由肽键组合而成。碱基与骨架之间是以亚甲羧键相连。与多肽相似的是,PNA也有N端和C端的差别。同时由于PNA没有如DNA,RNA上的磷酸基团,因此PNA与DNA,RNA之间缺乏电性相斥的现象,使得两者之间的结合强度大于DNA与DNA之间的结合。由于PNA既不属于多肽,也不属于核酸,因此,PNA不易被蛋白酶或核酸酶水解,无论在体内还是在体外,PNA都相当稳定,同时,由于碱基之间配对特异性极强,热稳定性高。基于此原理,PNA可以有如下应用:
Globin Reduction PNA: 血液中的globin mRNA占总mRNA的70%以上,会严重影响non-globin mRNA的扩增。在进行反转录以及随后PCR 扩增的过程中,PNA均可以用作序列特异的blocker,阻止globin的反应,从而使non-globin mRNA更容易被扩增出来。
PNA Mutyper: 结合PNA Clamp以及Real Typer技术,基于对Real-time PCR溶解曲线(Melting curve)分析,高效鉴别突变位点及突变类型。 
针对wild type DNA sequences设计PNA clamp probe,阻止wild type DNA扩增,针对mutant type DNA sequence设计含有fluorescent dye以及quencher的PNA detection probe,通过real-time PCR的melting curve鉴别突变位点。
由于PNA自身特性,PNA Mutyper能够准确高效鉴别低至一个位点的突变。
PNA Real Typer: 结合PNA Clamp以及Real Typer技术,基于对Real-time PCR溶解曲线(Melting curve)分析,高效鉴别突变位点及突变类型。 
针对wild type DNA sequences设计PNA clamp probe,阻止wild type DNA扩增,针对mutant type DNA sequence设计含有fluorescent dye以及quencher的PNA detection probe,通过real-time PCR的melting curve鉴别突变位点。
由于PNA自身特性,PNA Mutyper能够准确高效鉴别低至一个位点的突变。
PNA miRNA inhibitors: PNA与RNA的结合能力比DNA与RNA的结合能力强,因此 PNA 可以与相互配对的 miRNA 特异性结合,从而抑制 miRNA自身的调控作用。同时,我们将细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides, CPPs) 与 PNA miRNA Inhibitors相连,这样,无需转染试剂盒,PNA miRNA inhibitors即能够进入细胞内,达到抑制目标miRNA的目的。已有研究证明PNA miRNA Inhibitors 是体内试验的有效工具。 
PNA Clamp Kit: PNA Clamp技术是指PNA能够专一性的与野生型DNA结合,从而使野生型DNA不能作为模板进行PCR扩增;而突变型DNA,由于碱基的缺失或突变,PNA不能与其结合,从而使突变型DNA能够进行PCR扩增。 
PNA FISH Probes: PNA能够作为特异探针应用于基因检测。与DNA探针相比,PNA探针序列更短,所需浓度更低,杂交速度更快。并且PNA探针不带电荷,生物稳定性极高,特异性、亲和性和细胞通透性都比DNA更高,PNA在杂交中的高稳定性和对错配的高度分辨力使其具有作为探针的明显优势



PNA 序列设计指南
具体设计规则:
长度: 合成 PNA 序列一般不超过 18 个碱基,但不包括接头、氨基酸和标记物。
含有氨基酸: 可以把一个赖氨酸或半胱氨酸连在序列的 N 端或 C 端。
嘌呤含量: 富含嘌呤 PNA 易发生聚合反应且水溶性差。为了避免聚合反应,请遵循以下
原则:
1. 将嘌呤含量限制在 60%以下。.
例如:
GAT TAG CAG TCT ACG (可行- 嘌呤含量 < 60%)
2. 连续嘌呤不超过 4 个,而鸟嘌呤则不超过 3 个。
例如:
ATT AGG GGC ATC TAC (不可行- 连续 4 个 G)
CTA GAT AGA AGG TTC (不可行- 连续 6 个嘌呤)
3. 如果无法避免上述规则,可以考虑探针互补链。
例如:
GTA GAT GCC CCT AAT (可行-上面序列的互补序列,未违背任何准则)
GAA CCT TCT ATC TAG (可行-上面序列的互补序列)
避免自我互补序列 : 反向重复 、 发夹和回文序列 。由于 PNA/PNA 相互作用比
PNA/DNA 更强,这些类型的探针容易聚合。
1. 四个碱基互补是可行的, 但只含有 C 和 G 的除外。然而当它们被一个或多个碱基间隔
时,也是可行的。
例如:
GAT AATT GCA (可行 - 四个碱基互补)
GAT CCGG TAC (不可行- 只有 CCGG 互补)
TAT CCT GGT A (可行, CC, GG 隔了一个碱基)
2. 6 个及以上碱基互补是不可行的。
例如:
CTA TTA ATG CA (不可行 - 6 个碱基互补)
3. 当被一个或多个碱基间隔时,6 个碱基互补是可行的,但只含有 C 和 G 的除外。
例如:AGT GCT ACT (可行 - 中间有间隔 )
GCG GCT CGC (不可行 – 只有 G 和 C 互补)
4. 即使被一个或多个碱基间隔,8 个碱基互补也是不可行的。
例如:
ACTG T CAGT (不可行 - 8 个碱基互补)
一般规则:
我们强烈建议您设计逆平行的 PNA 探针。PNA 可以在任一方向形成双链,但逆平行取
向优先,形成最普通双链。对于反义和 DNA 探针类型应用,逆平行是最优先构象。当逆平
行取向时,PNA 探针的 N 端相当于 DNA 的 5’端。
PNA 熔点不同于 DNA 。由于 PNA 链是不带电的,PNA-DNA 的 T m 值会比相应
DNA-DNA 的高。通常情况下,100 mM NaCl 中,每增加一个碱基,其 T m 值提高约 1°C。
在较低盐浓度下,其 T m 值的差异将更加明显。通常,一个含 10 个碱基 PNA,其 T m 值
约 50°C,含 15 个碱基的 PNA T m 值约 70°C。
长度为 12 ~17 个碱基的 PNA 序列是最佳的。序列长度主要取决于其具体应用。与
DNA 的应用相比,PNA 探针序列需要的长度更短。链长的 PNA,根据序列,倾向于聚合,
不易纯化和表征 。然而,序列越短,特异性越差。因此,对于短序列来说,不匹配的影响
更大。


 

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